不仅操作麻烦，全自动氮吹仪而且成本很高，难于推广。只有 耐热 )*+聚合酶被发现后，聚合酶链反应才得到广泛的应用。 / / B=C )*+聚合酶是目前应用最广的耐热性 )*+聚合酶，是从一种在 -DE-F G温泉中生活的耐热菌 中分离提纯的，由 H60个氨基酸残基组成的蛋白质。该酶在 IF G处理 0%经过 FD个反应周期酶活性仍 可保持在很高水平。一次性加入可以满足反应的全过程需要。 B=C )*+聚合酶大约有 ,J, DDD的错配 率。目前已有高保真的 B=C )*+聚合酶。 / / ?@5可以在 )*+自动化扩增仪上很方便的进行。这种扩增仪可以根据输入的正确程序，自动的快速 的改变温度，调控各个循环周期中模板变性、模板和引物退火及引物延伸的温度转换，实现反应的自动化 操作。各种 ?@5反应的操作基本相同，反应体系中包括模板 )*+、两种引物、四种 K*B?、B=C )*+聚合酶 和缓冲液。每个循环周期包括三个反应步骤： / / ,L )*+模板变性 //变性温度一般为 IF G ,F8，待扩增的 )*+模板于高温下变性，双链解开，变成单链，作为聚合反应的 模板。 / / 0L模板与引物的退火 //退火温度一般为 FFG 6D8。在退火过程中，引物分别与待扩增的 )*+片段的两条链的 6M端互补配  #"!第三篇 !遗传信息的传递 对。由于引物的浓度大于待测模板的浓度，引物与模板结合的概率远大于模板的自身复性。 ! !"#引物的延伸 ! ! $%&酶的最适温度为 ’( )，在此温度下 $%&酶以单链 *+,为

模板将单核苷酸逐个加入到引物的 "端 ，使引物不断延长，从而合成新的 *+,链。新合成的引物延伸链在下一轮循环时便可以作为扩增的模 板。引物延伸的时间一般为 .#/ 012以上，反应步骤的温度和时间可以依据自己的试验要求自行设定，一 般要经过 (/ 3"4个循环。扩增产物需经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 !!在第一个反应周期中，分别以互补的两条 *+,链为模板，引物的延伸从模板的 "-端开始，这样新合成 链的 /-端是一段引物的序列， "-端则长短不等，称为“长产物片段”。从第二个反应周期开始，引物除与原 模板结合外，也与新合成的链结合。当引物与新合成的链结合时，由于新合成的链的 /-端序列是固定的， *+,聚合酶催化新链的延伸只能到此为止。这样就出现了 /-端和 "-端分别对应两种引物的产物片段，称 为“短产物片段”。从第二个反应周期起，短产物片段以指数的方式增加，长产物片段每个周期只增加两 个（图 .’ 5）。经过 (/ 3"4个循环后，短产物片段在反应体系中占有绝对优势，不必经过提纯即可用于 各种分析。

 图 .’ 5! 678工作原理及长片断 9短片断形成示意图 ! ! 678的主要用途是扩增微量的 *+,，理论上只要有一条双链 *+,作为模板，即可通过 678扩增到足 够下一步试验需要的 *+,量。 678的另一个主要用途是基因工程中获得目的基因。通过 678获得目的 基因要注意 $%& *+,聚合酶的错配率，尽可能选用高保真的 $%& *+,聚合酶。 678的第三种主要用途是 通过检测 08+,含量测定基因的表达水平。 678的第四种主要用途是进行定点突变。将待诱变的碱基 设计在引物中，当下一轮 678以引物延伸的链为模板扩增时， *+,的碱基就产生了定点突变。用这种方  第十七章 !基因技术#"! 法可以使蛋白质的氨基酸产生定向改变。 第四节 ! !"#的序列分析 ! ! "#$序列分析主要有双脱氧合成末端终止法和化学修饰法两种方法。 图 %& ’!双脱氧末端终止法测序  #"!第三篇 !遗传信息的传递 一、双脱氧合成末端终止法 ! ! "#$%$#&’( )*+,$#的双脱氧合成末端终止法实际上是一种试管内的复制 -./互补链并使之逐个核苷 酸延伸的比较分析方法。 ! ! -./序列分析除需要 -./的复制所必需的四个条件，即 -./聚合酶、单链 -./模板、带有 01羟基的 引物、四种脱氧核苷三磷酸（ %/23 %223 %423 %523）外，还需要四种脱氧核苷三磷酸的类似物 61，01一双 脱氧核苷三磷酸（%%.23）。%%.23能够以它的 71磷酸和它上一位的核苷酸形成正常的 01，71磷酸二酯键， 但是 %%.23没有 01羟基，下一个核苷酸不能与之形成 01，71磷酸二酯键，使